PlantCommunications

题目：ArabidopsistranscriptionfactorTCP4represseschlorophyllbiosynthesistopreventpetalgreening

期刊：PlantCommunications

发表年份：

.研究背景

.绿色花瓣的意义

绿色花瓣因昆虫难以辨认是花还是叶，对植物传粉很不利而在自然界中少见。但在花卉市场中，绿色花瓣因其罕见而具有很高的观赏价值与经济价值。绿色花卉的育种将成为大势所趋。

.2绿色花瓣产生的分子机理尚未可知

在拟南芥中，花苞期花瓣中含有叶绿体，其产生叶绿素使花瓣为绿色而后随发育使得远端变为白色，近端仍为绿色。这一过程涉及到叶绿体向白色体的转变，但由于缺少带有绿色花瓣的拟南芥突变体，因而不能从分子角度很好解释这一现象产生的原因。

阐明颜色形成和叶绿体重新分化成白色体的过程，将有助于我们对花卉发育演化的认识，并为观赏花卉的育种提供方法。

植物材料选用拟南芥野生型以及突变体tcp2/3/4/5/0/3/7和基于突变体突变体tcp2/3/4/5/0/3/7的突变体TCP4pro-TCP4-FLAG

通过选定不同色块进行表型测定、叶绿素含量以及透射电镜的观察，并对不同色块进行转录组测序分析差异表达基因以及后续相关生信分析。

3.CIN-likeTCP转录因子调控花瓣由绿色向白色的转变

合成的tcp2/3/4/5/0/3/7突变体体内无CIN-liketcp冗余，与野生型对照的白色花瓣相比花瓣保持绿色。以此突变体为重点研究对象旨在阐明拟南芥花瓣由绿色向白色转变的机制。在tcp2/3/4/5/0/3/7突变体的基础上合成突变体TCP4pro-TCP4-FLAG，其中FLAG标记融合到TCP4基因组DNA中，并由一个bp的TCP4启动子驱动。该突变体表型与野生型相似，这表明TCP4在花瓣发育过程中绿色向白色的转变中起着关键作用。

从花瓣的远端和近端分别收集组织样本进行叶绿素分析，结果表明tcp2/3/4/5/0/3/7花瓣的远端部分明显含有大量的叶绿素，而野生型对照花瓣没有，tcp2/3/4/5/0/3/7花瓣的近端部分和野生型花都检测到了叶绿素，说明tcp2/3/4/5/0/3/7花瓣的绿色是由叶绿素积累引起的。

通过透射电镜观察不同色部位的质体，结果表明，在花瓣近端区域，tcp2/3/4/5/0/3/7和野生型对照花瓣均含有叶绿体，叶绿体具有透明的类囊体膜，但没有明显的淀粉粒。野生型花瓣中绿色到白色过渡区的叶绿体中类囊体膜较少，淀粉粒积累，而tcp2/3/4/5/0/3/7叶绿体中类囊体结构丰富。在野生型花瓣的远端区域，叶绿体分化为含有多个淀粉粒但缺乏类囊体的白质体。相比之下，tcp2/3/4/5/0/3/7花瓣远端叶绿体中发现类囊体膜，表明这些花瓣远端叶绿体向白色体的转化受到阻碍。

通过叶绿素自身荧光和显微镜观察花发育早期叶绿体向白色体的转变，结果表明，在第9阶段，全花瓣显示明显的叶绿素自发荧光。野生型花在第0阶段的花瓣呈绿色，但远端区域的自身荧光较近端区域少。而tcp2/3/4/5/0/3/7花瓣在第9、0阶段的远端和近端叶绿素自身荧光强度相似。在第、2阶段，野生型花瓣远端区域颜色明显为白色，叶绿素自身荧光也相应消失。而tcp2/3/4/5/0/3/7花瓣远端大部分区域在第和2阶段仍保持绿色和叶绿素自身荧光。这些观察结果表明，tcp早在花第0阶段时就控制叶绿体向白质体的转化。

3.2在花瓣生长过程中，TCP4的表达受到发育调控

为了更好地理解TCP4在花瓣绿色颜色调控中的作用，我们分析了TCP4蛋白在花瓣发育过程中的表达模式。构建TCP4pro-TCP4-GUS，其中一个bp长的TCP4启动子驱动?-glucuronidase(GUS)报告基因与TCP4基因组DNA融合，被转化到拟南芥中。随后，选取稳定的TCP4pro-TCP4-GUS转基因植株进行GUS染色分析。

花序表现出明显的GUS活性，从花期0到花期2GUS染色较强。将花解剖，以便观察花瓣中GUS活性。在第7阶段，小花蕾的花瓣中没有TCP4的表达。然而，在第8阶段，花瓣尖端开始出现微弱的GUS染色。在阶段9、远端大约三分之一的花瓣长度有很强的GUS染色。从第0阶段到第2阶段，GUS活性从花瓣顶端延伸到基部，远端覆盖花瓣长度的一半以上。第3期，GUS染色开始消退。在3期前期，TCP4蛋白主要在花瓣的脉管系统中发现，而在3期后期，花瓣中未发现TCP4的表达。在花瓣近端区域未观察到TCP4蛋白表达，在所有花发育阶段都保持绿色。TCP4蛋白的表达模式与之前报道的TCP4基因转录模式一致。这些数据表明，TCP4蛋白的表达模式是受发育调控的，与花瓣的绿-白转换和最终的绿-白颜色模式有很好的对应关系，有力地证明了TCP4在花瓣叶绿体向白色体转化过程中发挥正向调控作用。

3.3tcp2/3/4/5/0/3/7主要抑制花瓣发育过程中的基因表达

为了确定TCP4控制花瓣中绿色-白色花色形成和质体转化的分子机制，我们收集了野生型和tcp2/3/4/5/0/3/77个突变体花的近端和远端花瓣组织，进行了3次重复的RNA测序(RNA-seq)。对野生型花的绿色近端组织和白色远端组织(WT近端vsWT远端，绿色vs白色)进行转录组分析。

结果发现差异表达基因个，包括个上调基因和个下调基因，表明基因抑制在远端白色组织中叶绿体转化为白质的过程中占主导地位。然而，tcp2/3/4/5/0/3/7近端组织与tcp2/3/4/5/0/3/7远端组织相比，仅发现个上调基因和66个下调基因(tcp近端vstcp远端，绿色vs绿色);在野生型花瓣远端组织中下调的基因中，有56%(/)以上的基因在tcp2/3/4/5/0/3/7花瓣的绿色远端没有出现低表达。说明tcp在花瓣叶绿体向白质体转化过程中对基因表达的抑制起着重要作用。与这些结果一致,年调节基因和0个表达下调基因的比较中发现了tcp2/3/4/5/0/3/7远端组织和野生型远端组织。此外，在tcp2/3/4/5/0/3/7近端组织与野生型近端组织的比较中发现了个上调基因和个下调基因(tcp近端vsWT近端，绿色vs绿色)，进一步证实tcp2/3/4/5/0/3/7在花瓣发育过程中对基因表达的调控，尤其是抑制表达起着关键作用。

野生型花瓣中有22个TCP家族基因。大多数CIN-likeTCP基因，包括TCP4、TCP0、TCP3、TCP5、TCP3和TCP2，在花瓣的远端表达水平较高，而大多数I类TCP基因，包括TCP23、TCP4和TCP5，在花瓣的近端表达水平较高。

观察到的TCP4和其他CIN-likeTCP基因在远端花瓣区域的显性表达与TCP4pro-TCP4-GUS报告基因揭示的TCP4蛋白表达模式以及花瓣中绿色和白色的分布相一致。

为了鉴定与拟南芥花瓣绿色相关的下游基因，我们进行了重叠DEGs分析。DEG分析显示，在WT近端与远端、tcp远端与远端表达比较中，有33个基因上调，35个基因下调，以及随后的分析集中于这两组绿色和白色的DEG。GO分析表明，基因与叶绿素生物合成、叶绿体和光合作用途径有关，在一组33个重叠的上调基因中高度富集，而35个重叠下调的基因中没有叶绿素相关基因或质体相关基因富集，说明tcp2/3/4/5/0/3/7抑制远端花瓣组织中叶绿体相关基因。

3.4tcp2/3/4/5/0/3/7通过抑制叶绿素生物合成相关基因促进花瓣颜色转换

CIN-likeTCP基因可能通过调控花瓣的颜色、形态、极性等过程来控制花瓣的发育。由于花瓣的绿色是由叶绿素产生的，我们基于RNA-seq数据评估了所有编码叶绿素生物合成、回收和降解酶的基因的表达水平。结果表明，几乎所有编码叶绿素生物合成途径相关酶的基因在野生型花瓣远端组织中都被抑制，而在野生型花瓣近端绿色组织以及tcp2/3/4/5/0/3/7花瓣的绿色远端组织中表达量较高。令人惊讶的是，一些与叶绿素回收或降解相关的基因在野生型花的白色花瓣组织中也被抑制。这一发现表明，花瓣的颜色变化是叶绿素生物合成减少而不是叶绿素降解增加的结果。

因为此前有报道称TCP5调节乙烯生物合成，乙烯是一种重要的植物激素，在叶绿素分解代谢和降解中起作用，我们通过搜索与乙烯生物合成和信号转导相关基因的RNA-seq数据，研究乙烯是否参与了花瓣变绿的预防。结果表明，与野生型白色花瓣组织相比，乙烯合成基因acc-氧化酶2(ACO2)在绿色花瓣组织中被诱导，而其他乙烯合成基因和信号基因在绿色花瓣组织中的表达水平变化不一致。即乙烯在防止花瓣变绿方面可能起不到关键作用。对转录因子(TF)基因表达水平的分析表明，编码SOC、COL6、WHY、WHY3和REM7的基因以及其他已知的积极调控叶绿素生物合成的转录因子在野生型和tcp2/3/4/5/0/3/7花的绿色花瓣组织中主要表达。这些结果表明，tcp2/3/4/5/0/3/7通过抑制积极调控叶绿素生物合成的多个基因的表达来控制花瓣的颜色转换。

3.5TCP4通过直接结合启动子调控叶绿素生物合成中的关键基因

为进一步证实TCP4通过抑制叶绿素生物合成而不是促进叶绿素降解来调控绿色花瓣的颜色。利用实时荧光定量PCR技术对野生型和tcp2/3/4/5/0/3/7花瓣近端和远端组织中参与叶绿素合成或降解的选定基因的表达水平进行了测定。结果表明所有六个选定的叶绿素生物合成基因在白色花瓣组织中都有较低水平的表达。相比之下，叶绿素降解基因，包括SGR和PAO在白色和绿色花瓣组织中表达水平相当，但PAO在tcp2/3/4/5/0/3/7花瓣组织中也上调。SOC在白色花瓣组织中的表达水平也下降，但在tcp2/3/4/5/0/3/7的绿色花瓣中表达水平上升，这与之前的一篇SOC过表达导致绿色花瓣的报道一致。

为了确定CIN-liketcp是否直接调控这些叶绿素生物合成相关基因，我们使用暗生长的幼苗分析了我们之前收集的TCP4染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)数据。结果表明，PORB、DVR和SOC的启动子区域与TCP4结合，在这些基因的启动子中发现了潜在的TCP4结合位点。然后，我们利用花的ChIP-PCR检测证实了TCP4与启动子的结合。结果显示，TCP4与TCP4结合的顺式元素附近显著富集。我们进一步通过电泳迁移率转移试验(EMSA)确认了TCP4直接与顺式元素结合。这些结果清楚地表明，TCP4通过影响SOC等其他转录因子，直接或间接地抑制叶绿素生物合成基因，从而促进叶绿体向白质的转化。

在这篇论文中，我们证明了CIN-likeTCPTFs通过直接或间接抑制叶绿素生物合成来抑制花瓣绿化。TCP4通过直接结合促进花瓣变绿的原叶绿素内酯还原酶(PORB)、二烯基还原酶(DVR)和过表达抑制因子(SOC)来抑制叶绿素的生物合成。这一发现揭示了花色形成的主要分子机制，为绿色花朵植物的育种提供了基础。

提出了TCP4在绿色花瓣控制中的功能模型。一方面，TCP4直接结合叶绿素生物合成基因的启动子PORB、DVR，下调其表达;另一方面，TCP4直接抑制SOC等可能的转录因子，间接抑制叶绿素生物合成基因的表达。叶绿素生物合成的下调可能导致叶绿体转化为白色体，使花瓣的颜色从绿色转变为白色。TCP多突变体TCP功能的中断可能会释放出对一些未知的、积极调控叶绿素生物合成的tf的抑制，从而导致绿色花瓣的形成。